只需通過簡單的一滴血就能成功的檢測腫瘤，并且針對腫瘤患者快速確定一項治療方案是否適合，還可以繼續(xù)監(jiān)測該治療方案在癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥之后的效果。這就是曾經(jīng)榮登2015年度MITTechnology Review十大突破技術(shù)榜單的“液體活檢”技術(shù)！而循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumor DNA, ctDNA）檢測便是“液體活檢”技術(shù)之一。

那到底什么是ctDNA？有什么用？能干什么？適用于哪些人？本文將以頭頸腫瘤為例，詳細(xì)介紹ctDNA在臨床腫瘤的診斷、用藥指導(dǎo)、腫瘤進(jìn)展檢測及預(yù)后等方面的應(yīng)用。

一、ctDNA背景

1、ctDNA臨床意義及應(yīng)用范圍

腫瘤細(xì)胞破裂后，細(xì)胞中的DNA釋放到血液中，這些DNA被稱為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA），與胎兒DNA可進(jìn)入母體外周血類似。這些DNA片段攜帶有相對完整的癌細(xì)胞基因組變異信息，包括SNP（點(diǎn)突變）、InDel（插入缺失）、CNV（拷貝數(shù)變異）、fusion（融合基因）等。因此，ctDNA可以全面反映癌組織的DNA變異情況。

表一.ctDNA研究進(jìn)展

檢出腫瘤類型：結(jié)直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤、頭頸癌和肝癌等

Dawson等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA檢測作為一種無創(chuàng)的檢測方法，能夠真實(shí)的反映實(shí)體腫瘤組織中的基因突變圖譜和頻率，是治療效果的評估及治療后臨床隨訪的重要檢測指標(biāo)，尤其在一些有典型臨床癥狀、檢查卻無特異性以及診斷困難的腫瘤中，可以避免復(fù)雜的、有創(chuàng)傷性的活檢，也能避免穿刺活檢所導(dǎo)致的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險。

2、目前ctDNA的主要檢測手段和缺陷

ctDNA檢測突變的最大難題是：眾多超低頻突變。含有突變的ctDNA僅占cfDNA的0.01-1%，在晚期癌癥中也僅能達(dá)到10%左右的量級，因此如何在大量正常DNA中分辨出超低頻突變就成為了一大難題。

表二.各大類技術(shù)的檢測突變下限

之所以難以繼續(xù)下探主要是由于PCR體系中的“馬太效應(yīng)”，即含有低頻突變的片段在幾十個PCR擴(kuò)增循環(huán)中會被占絕對主導(dǎo)地位的正常版本片段所掩蓋掉。針對ctDNA超低頻突變特點(diǎn)，目前只有數(shù)字PCR（DigitalPCR, dPCR）和暴力測序法可能達(dá)到更低的檢測下限。

dPCR的原理是將溶液模板分成大量小液滴，分配到不同的反應(yīng)單元，再分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測陽性液滴數(shù)量，根據(jù)泊松分布進(jìn)行絕對定量（圖一）。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以避免低頻突變信號被淹沒在大量正常信號中，缺點(diǎn)是通量低，一次只能檢測一個位點(diǎn)，而且儀器價格昂貴。

隨后發(fā)展的BEAMing技術(shù)，是一種增強(qiáng)型dPCR。原理是在磁珠上進(jìn)行dPCR后，利用熒光探針來區(qū)分基因是否發(fā)生突變，再用流式細(xì)胞儀分析熒光分布（圖二）。這種增強(qiáng)型dPCR方法使得PCR定量更準(zhǔn)確，也可以實(shí)現(xiàn)同時檢測少量幾個位點(diǎn)，而缺點(diǎn)是價格比普通的dPCR還貴，且還需要流式細(xì)胞儀。

TAm-seq技術(shù)，即標(biāo)記擴(kuò)增深度測序，是使用標(biāo)記擴(kuò)增之后進(jìn)行高達(dá)10000×以上的超深度測序（圖三）。這種方法理論上可以檢測出非特定的極低頻突變，但是成本非常高。加上此方法是進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，增大了其偏好性（圖一左邊的情形），并且不可避免的出現(xiàn)測序儀器誤差，對算法要求極高，因此實(shí)際的穩(wěn)定檢出下限只有1-2%左右。

此外，癌癥個體化深度測序（CAPP-seq）技術(shù)[3]為了解決多位點(diǎn)、高偏好性下測序成本高的問題，則采取盡量減少檢測位點(diǎn)數(shù)量策略。此策略首先對腫瘤組織的外顯子組或者全基因組進(jìn)行測序，獲得個體特有的腫瘤突變，再根據(jù)此分析結(jié)果設(shè)計少量的檢測位點(diǎn)進(jìn)行ctDNA深度測序。且不說此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，單從“液體活檢”、“無創(chuàng)活檢”理念出發(fā)，CAPP-seq技術(shù)就不符合要求，因為CAPP-seq技術(shù)首先要求對腫瘤組織進(jìn)行測序，這就使得個體定制化商業(yè)成本非常高。

另外，ctDNA的保存和提取也是ctDNA檢測突變所面臨的另一個挑戰(zhàn)。首先采血的保存和運(yùn)輸遇到的冷凍問題導(dǎo)致提取量極不穩(wěn)定；而保存運(yùn)輸以及血漿的制備過程中出現(xiàn)的微量溶血也會造成提取ctDNA失敗，即使使用昂貴的專用ctDNA采血管，實(shí)測溶血率也很高。

二、技術(shù)發(fā)展更新

針對目前國內(nèi)外對ctDNA的檢測手段存在的困難，有相關(guān)企業(yè)經(jīng)過不斷鉆研、創(chuàng)新，給出了一個強(qiáng)有力的解決方案，結(jié)合ddPCR（DropletDigital PCR）系統(tǒng)的低偏好性和大規(guī)模測序的多重位點(diǎn)檢測能力和未知突變的檢測能力，自主研發(fā)的低成本ctDNA提取和保存方法，以及高精度全自動化的云平臺，使得ctDNA的檢測難題迎刃而解。

1、低偏好性RaindanceddPCR系統(tǒng)擴(kuò)增

采用RaindanceddPCR系統(tǒng)。ddPCR系統(tǒng)的靈敏度主要由液滴數(shù)量和液滴體積兩個參數(shù)共同決定，液滴數(shù)量越多、液滴體積越小，系統(tǒng)的性能就越高。與傳統(tǒng)的Bio-rad系統(tǒng)20000個液滴相比Raindance擁有800倍的液滴數(shù)量（總共1600萬液滴），可以檢測更高的動態(tài)范圍以及更低的檢測下限。而相比于Bio-rad850pL的液滴體積，Raindancedd PCR液滴體積要小得多（4.4pL），可以提高局部模板濃度，提高擴(kuò)增效率，同時檢測更多的位點(diǎn)（圖四）。此外，Raindance目前還推出2款配套試劑盒，在樣本起始量低至10ngDNA的情況下，即可使97%的序列覆蓋度達(dá)到500×，實(shí)現(xiàn)對FFPE、組織樣品中50個腫瘤基因序列（230對擴(kuò)增引物）和血液中49個腫瘤基因序列（548對擴(kuò)增引物）進(jìn)行靶向富集和分析，內(nèi)容全面，覆蓋度高，例如AML、MDS、MPN等，還包括比較難檢測的CEBPA和NOTCH1基因等。

此外，Raindance ddPCR系統(tǒng)的試劑兼容性較好，可與Raindance儀器生產(chǎn)廠家建立合作關(guān)系，取得其技術(shù)支持，在定制開發(fā)方面打造優(yōu)勢。

2、測序和分析策略

采用Illumina/ion平臺，根據(jù)不同的測序目的進(jìn)行測序策略調(diào)整以及測序平臺的選擇：偏重科研性質(zhì)、對成本較為敏感的可選擇Illumina平臺；偏重臨床應(yīng)用，對速度較為敏感的可選擇iontorrent平臺。根據(jù)目標(biāo)需求，可實(shí)現(xiàn)單位點(diǎn)或多位點(diǎn)同時測序，且可覆蓋臨近區(qū)段，檢測未知突變。

依托高精度FANSe系列算法，可保證測序數(shù)據(jù)分析的可靠性，利用基因云分析平臺實(shí)現(xiàn)快速自動化分析，操作簡便，價格更實(shí)惠。

3、低成本cfDNA穩(wěn)定保存和提取

采用創(chuàng)新的促凝管方法提取cfDNA，可低成本的穩(wěn)定保存和提取cfDNA。試驗低成本cfDNA穩(wěn)定保存和提取方案，若以懷孕<8周孕婦外周血為例，胎兒DNA在母體cfDNA中的比例在0.5%以下情況下，利用自主研發(fā)的促凝管方法檢測男嬰的Y染色體基因座（多重PCR）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該低成本方案，cfDNA冷藏2周后提取無降解，較難擴(kuò)增的第2、3管效果甚至明顯好于傳統(tǒng)當(dāng)場立即提取方案。

參考文獻(xiàn) 

[1]Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, Kinde I, Wang Y, Agrawal N, et al. Detectionof circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sciencetranslational medicine. 2014;6:224ra24.

[2] Dawson SJ,Tsui DW, Murtaza M, Biggs H, Rueda OM, Chin SF, et al. Analysis of circulatingtumor DNA to monitor metastatic breast cancer. The New England journal ofmedicine. 2013;368:1199-209.

[3] Newman AM,Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, et al. An ultrasensitivemethod for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.Nature medicine. 2014;20:548-54.

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